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绪论 |
我们将介绍我们自己的大概情况。同学们可以谈谈自己选修本课程的原因以及希望通过本课程学到什么。授课老师会给出关于本课程的教学大纲和教学目的的简要介绍。然后，我们将介绍荧光成像的相关背景知识：何为荧光，为何使用荧光进行检测，怎样的化学结构可以发出荧光，如何观察荧光？我们将讨论原创论文的格式并对如何批判性地分析一篇论文给出建议。我们会推荐后面几周要用到的两篇文章。 |
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绿色荧光蛋白的发现 |
绿色荧光蛋白(GFP)引发了一场认识活细胞中基因表达和信号传递的革命，因为其可在无任何辅因子参与下发出荧光。而像藻红蛋白和光敏色素就需要辅因子才能发光，那些辅因子只在特定生物体中合成且难以从细胞中分离出来。我们将通过阅读关于第一次纯化和分析GFP，并首次展示GFP被克隆到原核或真核宿主细胞后产生荧光的文章见证这些历史性的背景。 这项发现打开了广泛使用GFP融合蛋白作为标记物来定位蛋白质的大门。
注意：书面作业所需的底稿会在课程快结束时分发给各位。 |
Morise, H., O. Shimomura, F. H. Johnson, and J. Winant. "Intermolecular
Energy Transfer in the Bioluminescent System of Aequorea."
Biochemistry 13, no. 12 (June 4, 1974): 2656-62.
Chalfie, M., Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, and D. C. Prasher.
"Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression."
Science 263, no. 5148 (February 11, 1994): 802-5. |
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荧光蛋白工程技术 |
绿色荧光蛋白起初是从水母中提取出来的，当时并不是理想的工具。黯淡，37°C下不折叠，发光性具有pH敏感性且不感光。 后来，渐渐的，通过重组体的筛选和定向进化使这些缺陷得以弥补。这些方法再加上可从其他生物体分离到荧光蛋白，就使得荧光蛋白的光谱选择性可从蓝跨越到红。这样就可以在同一个细胞中追踪多种蛋白质。我们会讨论GFP的晶体结构, 其结构阐明了使荧光蛋白发光的化学反应，而此反应为合理的工程技术提供了基础。然后我们将探讨为使红色荧光蛋白适用于示踪细胞中的蛋白质所付出的巨大努力。 |
Yang, F., L. G. Moss, and G. N. Phillips, Jr. "The Molecular
Structure of Green Fluorescent Protein." Nat Biotechnol 14, no.
10 (October 1996): 1246-51.
Campbell, RE., O. Tour, AE. Palmer, P. A. Steinbach, G. S. Baird, D. A.
Zacharias, and R. Y. Tsien. "A Monomeric Red Fluorescent Protein."
Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99, no. 12 (June 11, 2002):
7877-82. |
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荧光蛋白突变体作为细胞动力学的探针 |
许多荧光蛋白只可发出单色光，不过有少数几种特殊的可以发出双色光，或者是自然状态下不发出荧光但在激活状态下可发荧光。荧光的发出决定于生色团周围的化学环境，例如氨基酸的空间排布，以及特定氨基酸的质子化状态。本课中，我们将见证两种荧光蛋白突变体。 一种可以随时间从绿色变为红色，而另一种可以在紫色光照射的诱导下发出荧光。我们将讨论这些已被用于研究胚胎发育过程中基因表达和溶酶体间的蛋白质运输的荧光蛋白突变体 |
Terskikh, A., A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A. V.
Kajava, X. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, and P.
Siebert. "Fluorescent Timer: Protein that Changes Color with Time."
Science 290, no. 5496 (November 24, 2000): 1585-8.
Patterson, G. H., and J. Lippincott-Schwartz. "A Photoactivatable GFP
for Selective Photolabeling of Proteins and Cells." Science 297,
no. 5588 (September 13, 2002): 1873-7. |
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非荧光蛋白的标记探针 |
所有的标记和成像蛋白都存在缺陷。荧光融合蛋白并非在所有应用中都是理想的。它们由于过大会扰乱与他们融合的蛋白的功能。 而且荧光蛋白不能为像染料分子这样的小分子寻找靶标提供协助。 已经开发出一些巧妙的方法将小分子锚定到活细胞的特异的肽链或者蛋白。由于同样的氨基酸可组成上千种不同的蛋白质，因此这在化学上是一个巨大的挑战。本课中，我们将讨论一种依靠小分子和一种特异的肽序列的方法，以及另一种依赖工程改造的酶-底物相互作用的方法。 通过对这些文章进行的讨论，我们将试着定义一个理想的分子标记体系的特征。
注意：要求在本堂课开始前交书面作业。 |
Griffin, B. A., S. R. Adams, and R. Y. Tsien. "Specific Covalent
Labeling of Recombinant Protein Molecules Inside live Cells."
Science 281, no. 5374 (July 10, 1998): 269-72.
Juillerat, A., C. Heinis, I. Sielaff, J. Barnikow, H. Jaccard, B. Kunz,
A. Terskikh, and K. Johnsson. "Engineering Substrate Specificity of
O6-Alkylguanine-DNA Alkyltransferase for Specific Protein Labeling in
Living Cells." Chembiochem 6, no. 7 (July 2005):
1263-9. |
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参观荧光显微装置 |
我们将参观癌症研究中心的荧光显微设备看看本课程中相关原理是怎样付诸实践的。我们将看到细胞表达不同颜色的荧光蛋白在活细胞中的成像以及使用可发荧光的GFP与RNA结合蛋白(第三节课和第四节课)。我们还将看到可为用于蛋白质示踪的荧光蛋白提供替代的无机荧光基团(第五节课)。我们也将讨论显微镜技术的现实问题以及为活细胞成像设计的软件。 另外，我们还会在各位的书面作业的基础上继续讨论。 |
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再现分子生物学中的中心法则 |
Francis Crick 在1958年提出“中心法则”来描述细胞的一切过程，即通过DNA转录为RNA，RNA翻译为蛋白质。从此，研究人员通过开发用于研究转录和翻译的分离系统，分别独立地从各自的角度有代表性的验证了中心法则。在本节课中，我们首先讨论一种通过荧光蛋白的巧妙使用，可在活细胞中同时对DNA，RNA和蛋白质进行示踪的系统。这项技术揭示了哺乳动物细胞中基因组结构在转录激活后发生怎样的改变。然后，我们将讨论另一种使用荧光标记的RNA“信标”示踪胚胎发育中一种特异的mRNA的迁移。 |
Janicki, S. M., T. Tsukamoto, S. E. Salghetti, W. P. Tansey, R.
Sachidanandam, K. V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R. H.
Singer, and D. L. Spector. "From Silencing to Gene Expression: Real-Time
Analysis in Single Cells." Cell 116, no. 5 (March 5, 2004):
683-98.
Bratu, D. P., B. J. Cha, M. M. Mhlanga, F. R. Kramer, and S. Tyagi.
"Visualizing the Distribution and Transport of mRNAs in Living Cells."
U.S.A. Proc Natl Acad Sci 100, no. 23 (November 11, 2003):
13308-13. |
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细胞信号传感器：荧光共振能量转移（FRET） |
细胞信号的传递发生在毫秒的时间尺度和微米的空间界限上，这一点已经被神经细胞所清楚地阐明，这些细胞能在其他一千多个突触保持静息状态下使一个突触快速激活。传统的分析信号峰的手段涉及到在一个时间点固定或冷冻上千个细胞，而且为了随后的对相关信号分子的试验要把细胞磨成粉末。通过荧光报告蛋白的使用细胞信号活动可以在活细胞与活组织中实时观察。 先前基于染料的细胞信号荧光报告物必须被显微注射进细胞或者通过细胞媒介扩散到细胞中。由于荧光蛋白的出现，新一代荧光报告物能够和特异性细胞组分及细胞类型靶向结合。这些荧光报告物是基于荧光共振能量转移现象(FRET)。 我们将解释FRET基本原理，我们还将在第一篇文章的基础上讨论第一个转基因编码FRET是如何被构建的。我们接着会看到果蝇肌肉收缩时钙的变化的影像为背景，与改进的FRET报告物的对比。
注意：要求各位在上课前为自己的口头作业选择好参考文献，并征得授课教师的同意。 |
Miyawaki, A., J. Llopis, R. Heim, J. M. McCaffery, J. A. Adams, M.
Ikura, and RY. Tsien. "Fluorescent Indicators for Ca2+ based on Green
Fluorescent Proteins and Calmodulin." Nature 388, no. 6645
(August 28, 1997): 882-7.
Reiff, D. F., A. Ihring, G. Guerrero, E. Y. Isacoff, M. Joesch, J.
Nakai, and A. Borst. "In Vivo Performance of Genetically Encoded
Indicators of Neural Activity in Flies." J Neurosci 25,
no. 19 (May 11, 2005): 4766-78. |
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高灵敏定量荧光成像 |
细胞生物学家有时会被指责只做出一些好看的图片跟得出一些定性的结论。然而，按的1:1比例将GFP与目标基因融合就可在无需扩增的条件下得到足量的信号，这就为定量分析创造一个很好的基础。我们还将讨论如何利用荧光蛋白定量测定遍布细胞核和核间隙的蛋白质运动。传统地，生物学家一次研究数百甚至数百万的的分子，通过上面的改进，相机，显微制图加上荧光蛋白意味着生物学家开始一次能够探索单个分子的活动。这样高灵敏度的检测手段揭示了包括随机现象在内的分子活动的新特点，而且通过光的衍射允许分辨率低于一般显微限度。我们将通过一篇论文来阐述这种高灵敏度的检测手段，该文着眼于单个神经递质受体在神经元表面的扩散，精度达到45 nm。 |
Phair, R. D., and T. Misteli. "High Mobility of Proteins in the
Mammalian Cell Nucleus." Nature 404, no. 6778 (April 6, 2000):
604-9.
Tardin, C., L. Cognet, C. Bats, B. Lounis, and D. Choquet. "Direct
Imaging of Lateral Movements of AMPA Receptors inside Synapses." EMBO
J 22, no. 18 (September 15, 2003): 4656-65. |
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学生课程陈述 |
每位同学要就一篇关于荧光蛋白的文章进行陈述。文章应选择能展示荧光成像技术在阐释诸如基因表达和细胞信号传递等生物学问题时较其他方法的优势，陈述的时间控制在10-20分钟，后面留3-5分钟进行提问和讨论。建议使用ppt作为辅助。目的是提高你们与同行进行科学上的交流的能力。陈述的首要目的是介绍文章的背景然后解释清楚做了些什么实验。在最后一张幻灯片提出一个以后的试验方案。 |
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荧光成像用于高通量分析的优势 |
高通量检测技术，像质谱技术和微阵列技术已经成为研究多个基因表达及基因表达产物实验中的标准工具。然而，尽管其十分有用，这些方法只能给出一大群细胞的一个平均状态的信息并不能提供时间和空间的足够分辨率。从同样空间体积中区分多种色彩的能力使得基于荧光的影像技术成为并行研究多个细胞过程的理想工具。本课时，我们将验证两种基于荧光的影像分析技术，这种技术可从一个细胞以高通量提取多个参数，包括基因表达的大概情况，亚细胞组织和细胞周期的状态。 |
Wheeler, D. B., S. N. Bailey, D. A. Guertin, A. E. Carpenter, C. O.
Higgins, and D. M. Sabatini. "RNAi Living-Cell Microarrays for
Loss-Of-Function Screens in Drosophila Melanogaster Cells."
Nat Methods 1, no. 2 (November 2004): 127-32. Epub (October 21,
2004).
Neumann, B., M. Held, U. Liebel, H. Erfle, P. Rogers, R. Pepperkok, and
J. Ellenberg. "High-Throughput RNAi Screening by Time-Lapse Imaging of
Live Human Cells." Nat Methods 3, no. 5 (May 2006):
385-90. |
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活体中的荧光成像 |
荧光蛋白常被用于分离的细胞来研究mRNA和蛋白质的动态研究细胞信号传递。然而，对于完整生物体中细胞示踪和细胞信号传递，荧光蛋白也是有力的工具。我们将讨论荧光成像技术用于大的生物个体的困难以及诸如双光子显微术的方法然后解决这些困难。我们将把荧光成像与其他成像技术，如，核磁共振和正电子发射断层成像，这些主要在医院用。第一篇文献关于活鼠体内T细胞的追踪，试图揭示免疫反应的起始。第二篇文章描述了如何使用GFP了解受到蚊子叮咬而感染疟疾的寄主的命运。 |
Miller, M. J., S. H. Wei, I. Parker, and MD. Cahalan. "Two-Photon
Imaging of Lymphocyte Motility and Antigen Response in Intact Lymph Node."
Science 296, no. 5574 (June 7, 2002): 1869-73.
Amino, R., S. Thiberge, B. Martin, S. Celli, S. Shorte, F.
Frischknecht, and R. Menard. "Quantitative Imaging of Plasmodium
Transmission from Mosquito to Mammal." Nat Med 12, no. 2
(February 2006):
220-4. |